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一株养殖场乌鸡源H7N9流感HA基因的序列分析


现代畜牧网 http://www.brainbulb.net 2018/11/28 17:31:26 关注:76 评论: 我要投稿

  摘要:H7N9流感的宿主主要是鸡,本研究对1株养殖场乌鸡源H7N9流感HA基因的序列进行测定,分析其分子特征,发现该毒株与当地流行的毒株核苷酸相似性较高,达98.7%,说明本次养殖场的乌鸡感染事件由本地区流行毒株引起。该病毒HA蛋白潜在的糖基化位点与其他参考毒株一致,均为5个,分别位于30~32、46~48、249~251、421~423、493~495位氨基酸。裂解位点为PEIPKG/RGLF,呈弱毒的分子特征。受体结合位点中,235位Q(H3编码226位),仍保持禽源与α-2,3受体结合的特征,但195位(H3编码186位)与169(H3编码160位)位均出现了适应人与α-2,6Gal受体结合的特征。本文为H7N9病毒感染不同宿主后的分子特征的研究提供有益的补充。
  关键词:H7N9  乌鸡  HA  序列分析
  H7N9流感自2013年在华东地区出现已来, 已在多个省市流行,并造成了1000余人的感染,严重危害公共卫生安全和家禽产业的发展。随着H7N9的流行,其宿主范围也在不断扩大,当前已确认的易感禽类有鸡、鸭、鹅、鸽、麻雀和鹌鹑等,为适应不同的宿主,病毒在分子水平上也会相应的发生不同的变异。2016年12月广东某供澳乌鸡(竹丝鸡)场发生了感染,本文旨在通过对该宿主来源病毒HA基因的序列测定与分析,为该病的防控提供依据。
  1 材料与方法
  1.1 材料
  1.1.1 样品:拭子样品1份,采集于供澳乌鸡场,该场禽群均无临床表现。
  1.1.2试剂:抽提试剂RNAiso Reagent、一步法RT-PCR扩增试剂(PrimeScript? One Step RT-PCR Kit ),购自宝生物工程(大连)有限公司。
  1.1.3 HA基因的扩增引物:上游引物P1:5`- cgagtgagcaaaagcaggggatacaa-3`;下游引物P2:5`- ccctctccctgtgcattctggtgtct-3`,P3: 5`-aagcagggatacaaaatgaac-3`;下游引物P4:5`- ccctccactatgatagcagtcc-3`,上海立菲生物工程有限公司合成。
  1.2 方法
  1.2.1 RNA的提取:按抽提试剂操作说明书进行。
  1.2.2  HA基因扩增体系与程序:上、下游引物(25μM)各1μL、2×Bμffer 25μL、PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 2μL 、DEPC水11μL和所提取的病毒RNA 10μL,体系共50μL,反应程序为50℃ 30min,95℃ 2min,然后95℃ 30s、53℃ 30s、72℃ 2min,30个循环,72℃延伸8min。
  1.2.3 序列测定和分析
  将PCR产物送上海立菲生物工程有限公司进行测序,结果用DNAstar软件进行序列拼接。并与下载自GenBank 的11株不同时期的H7N9 亚型禽流感病毒HA基因组序列进行比较, 采用MEGA 5.0软件绘制其HA因组的系统进化树。
  2  结果与分析
  2.1 HA 基因扩增结果:
  扩增出大小分别为901bp和979bp的特异性条带,与设计预期相符,见图1。
  图1  PCR扩增结果


  M、DNA Marker DL2000;1-2、P1P2扩增结果;3、P3P4扩增结果2.2 HA基因遗传进化分析
  将乌鸡毒株A/silker chicken/GD01/2016序列(已上传Genbank,序列号MG607400),通过与Genbank上收录的序列进行比较,结果相似性最高的为KP415932(chicken/Dongguan/191/2014),二者核苷酸的相似性为98.7%,处于同一分支的还有KP418167(silkie chicken/Shantou/2056/2014),相似性为98.5%。与其他有关参考毒株的相似性较高,介于95.3%~98.5%,其中与早期的参考毒株A/Anhui/2013、KP414851(silkie chicken/Jiangxi/9476/2014)相似性较高,均为98.2%;与另3株市场中检测到的竹丝鸡相似性为95.3%~98.5%毒株,见图2。
  图2 H7N9 HA基因的系统进化树


  2.3 HA 基因氨基酸序列分析
  该株病毒的cDNA均包含了1个完整的开放阅读框架(ORF),编码区长1683bp,共编码560个氨基酸(aa),包括信号肽(1~16aa),HA1(19~338aa),HA2 (340-560aa)和1个精氨酸(339aa)。
  2.4 糖基化位点的分析与裂解位点
  氨基酸序列分析结果表明,HA基因的潜在糖基化位点分别位于30~32、46~48、249~251、421~423、493~495位aa等5个位点上,位点1~3位于HA1,位点4~5位于HA2。与所有参考毒株均一致。裂解位点方面,毒株A/silkie chicken/GD01/2016与呈现弱毒的分子特征,PEIPKG↓RGLF,与其他毒株一致,详见表1。


  2.5 受体结合位点
  参照陈国清等分析方法,HA蛋白氨基酸143-147位为VTSAC(右侧壁),169位为A,195位为V,199位为E,233~238位为NGQSGR(左侧壁)。与早期代表株相比,有2个氨基酸位点发生了变化,一个是143A→V,这与人源毒株有差异;另一个是235位Q(H3编码226位),仍保持禽源与α-2,3Gal受体结合的特征,未出现人源毒株为L的突变,但195位(H3编码186位)与169(H3编码160位)位均出现了适应人与α-2,6Gal受体结合的特征,详见表2。


  3 讨论:
  3.1 由于本毒株与2014年KP415932(chicken/Dongguan/191/2014)HA基因相似性高达98.7%,推测其由当地流行毒株所引起,经乌鸡传播后也未出现明显的变异。
  3.2 乌鸡在H7N9传播过程中的作用。我们在日常检测中发现乌鸡较普通鸡更易感,需引起注意。Lam TT等于H7N9流感流行初期(2013~2014年)在汕头、江西、韶兴等地的乌鸡样品中检出大量病毒。推测除了乌鸡在H7N9的传播中可能扮演重要角色。
  3.3 受体结合位点适应性变化。唾液酸受体主要有两种,包括含有α-2,3和α-2,6半乳糖苷键的受体。其中α-2,3受体常见于禽类,而人类上呼吸道表面更多见的是α-2,6受体。增强感染的突变位点主要有HA上同时发生Q226L、G186V、T160A突变,其中Q226L、G186V两个同时突变,较只发生1个突变的感染人能力强。此外,HA受体结合区150环发生T160A突变减弱了病毒与α-2,3Gal受体的结合能力,同样导致病毒结合人类受体的能力增加[4],本毒株G186V、T160A有与人受体结合的变异,但235位Q(H3编码226位),仍保持禽源与α-2,3Gal受体结合的特征,同时143位为V(H3编码132位)发生了变异。这也许是H7N9病毒在养殖场中传播后发生的适应乌鸡的宿主的变化。
  3.4 以往报道的低致病力H7N9病毒主要来源于活禽交易市场,养殖场中罕有报道,本文首次对养殖场乌鸡的H7N9病毒HA序列进行分析,为H7N9病毒感染不同宿主后的分子变异特征的研究提供有益的补充。
  致谢:样品由江门市动物疫病预防控制中心送检。

文章作者:广东省动物疫病预防控制中心 卢受昇,孙彦伟,查云峰,叶健,吴立炀     文章编辑:一米优讯     
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